熒光定量PCRZ常用的方法

     熒光定量PCR檢測zui常用的方法：
    理論上PCR是一個指數(shù)增長的過程，但是實(shí)際的PCR擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線。
    這是因?yàn)殡S著PCR循環(huán)的增多，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來越低，產(chǎn)物增長的速度就逐漸減緩。當(dāng)所有的Taq酶都被飽和以后，PCR就進(jìn)入了平臺期。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不同的PCR反應(yīng)體系進(jìn)入平臺期的時機(jī)和平臺期的高低都有很大變化，難以控制。所以，即使是96次PCR重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各種條件基本一致，所得結(jié)果有很大差異，所以在實(shí)驗(yàn)過程中我們不能根據(jù)zui終PCR產(chǎn)物的量直接計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。
    熒光定量PCR檢測的方法：
    熒光定量PCR檢測所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。而熒光定量 PCR 的方法相應(yīng)的可分為特異類和非特異類兩類，特異性檢測方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產(chǎn)物；而非特異性檢測方法是在在PCR反應(yīng)體系中，加入過量熒光染料，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射出熒光信號。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。
    熒光定量PCRzui常用的方法是DNA結(jié)合染料SYBR GreenⅠ的非特異性方法和Taqman水解探針的特異性方法，在這里主要介紹這2種方法，其它方法請參考其它熒光定量PCR資料。
    1、非特異性SYBR Green I染料法
    SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料（結(jié)合示意圖），在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)（作用機(jī)理圖）。因此，SYBR Green I的熒光信號強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。
    2、特異性Taqman水解探針法
    Taqman熒光定量技術(shù)是以Taqman熒光探針為基礎(chǔ)，Taqman熒光探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個熒光發(fā)射基團(tuán)和一個熒光淬滅基團(tuán)。探針完整時，發(fā)射基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；
    PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。從而實(shí)現(xiàn)定量（如下圖）。常用的熒光基團(tuán)是FAM, TET, VIC, HEX。